Die Evolutionsgeschichte der Brachyury-Gene in Hydrozoa beinhaltet Duplikationen, Divergenz und Neofunktionalisierung

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9382 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Brachyury, ein Mitglied der T-Box-Genfamilie, ist weithin für seine wichtige Rolle bei der Mesodermspezifikation bei Bilateriern bekannt. Es kommt auch in nicht-bilateralen Metazoen wie Nesseltieren vor, wo es als Bestandteil eines axialen Mustersystems fungiert. In dieser Studie präsentieren wir eine phylogenetische Analyse von Brachyury-Genen im Stamm Cnidaria, untersuchen die unterschiedliche Expression und befassen uns mit dem funktionellen Gerüst von Brachyury-Paralogs im Hydrozoan Dynamena pumila. Unsere Analyse weist auf zwei Duplikationsereignisse von Brachyury innerhalb der Nesseltierlinie hin. Die erste Duplikation erschien wahrscheinlich beim Medusozoen-Vorfahren, was zu zwei Kopien bei den Medusozoen führte, während die zweite Duplikation beim Hydrozoen-Vorfahren auftrat, was zu drei Kopien bei den Hydrozoen führte. Brachyury1 und 2 zeigen ein konservatives Expressionsmuster, das den oralen Pol der Körperachse in D. pumila markiert. Im Gegenteil, die Brachyury3-Expression wurde in verstreuten, vermutlich Nervenzellen der D. pumila-Larve nachgewiesen. Pharmakologische Modulationen deuteten darauf hin, dass Brachyury3 im Gegensatz zu den beiden anderen Brachyury-Genen nicht der Regulierung des cWnt-Signals unterliegt. Unterschiede in den Expressionsmustern und der Regulierung lassen auf eine Neofunktionalisierung von Brachyury3 in Hydrozoen schließen.

Brachyury (oder T) ist ein Gründungsmitglied der T-Box-Transkriptionsfaktorfamilie1, die erstmals in einem mutierten Mausstamm2 identifiziert wurde. Mäuse, denen ein Brachyury-Allel fehlt, weisen einen Kurzschwanz-Phänotyp auf3, während der vorgeburtliche tödliche Verlust beider Allele zu schwerwiegenden Mängeln bei der Bildung des Mesoderms und der axialen Struktur führt4,5. Nachfolgende Studien zeigten, dass Brachyury hoch konserviert ist und nicht nur in Akkordaten, sondern in den meisten metazoischen Tieren, von Ctenophoren bis zu Seeigeln, sowie in Ichthyosporen, Filasteräern und mehreren früh verzweigten Pilzen vorhanden ist6,7,8,9.

Brachyury spielt eine entscheidende Rolle bei der Notochordbildung in verschiedenen Chordaten (Übersicht in 10) und der Mesodermspezifikation in Bilateria im Allgemeinen (Übersicht in 11), und seine evolutionäre Primärfunktion ist möglicherweise mit der Abgrenzung der Keimschicht und der Morphogenese während der Gastrulation verbunden12,13. Es ist auch ein wichtiger Bestandteil des Genregulationsnetzwerks für die axiale Musterung14.

Obwohl die Funktionen von Brachyury bei einer begrenzten Anzahl von Arten untersucht wurden, sind die Muster seiner Expression während der Embryonalentwicklung gut untersucht. Eine der Brachyury-Expressionsdomänen wird konservativ an einem Pol der Körperachse nachgewiesen (z. B. oraler Pol bei Nesseltieren, hinterer Pol bei Deuterostomen)15,16,17,18, wo sich die Stelle der Zellinternalisierung auch in den Gastrulae von befindet die meisten Tiere. Innerhalb von Hydrozoen wurde die Brachyury-Expression an der Stelle des Zelleintritts während der Gastrulation in den Embryonen von Clytia hemisphaerica nachgewiesen19. Brachyury wird um eine Blastopore herum in Ctenophoren8, Anthozoen12,20, Stachelhäutern21,22, Amphioxus23 und allen bisher untersuchten Wirbeltieren (Übersicht in 10) exprimiert, obwohl diese Expressionsdomäne bei Ascidianen verloren ging24. Bei Ringelwürmern, Mollusken und Insekten ist die Brachyury-Expression auch mit der Blastopore verbunden, obwohl sich diese Expressionsdomäne in unterschiedlichem Maße auflöst (Übersicht in 11).

Eine einzelne Kopie des Brachyury-Gens ist im Genom der meisten Metazoen vorhanden. Es gibt jedoch mehrere Ausnahmen. Innerhalb der Akkordaten verfügt Xenopus laevis über vier Brachyury-Gene 25,26, wobei tbxt.L/tbxt.S (Xbra und Xbra2) und tbxt.2.L/tbxt.2.S (Xbra3) jeweils als Alloallele betrachtet werden, die aus entstehen die jüngste Genomduplikation25,26,27. X. Tropicalis enthält zwei Brachyury-Gene, von denen eines mit Xbra/Xbra2 (tbxt) geclustert ist und das andere dem Xbra3-Gen von X. laevis (tbxt.2) entspricht28. Knochenfische wie Medaka, Zebrafisch und Dreistachliger Stichling besitzen zwei Brachyury-Gene (Bra und Ntl) in ihren Genomen28,29. Brachyury ist in zwei Exemplaren im basalen Chordatum Amphioxus vorhanden23,30,31. Laut phylogenetischer Analyse traten Duplikationsereignisse nicht beim Akkordat-Vorfahren auf, sondern unabhängig voneinander in allen drei Akkordat-Linien28,32. Unter den nicht-chordaten Metazoen verfügen die Hydrozoen Hydra und C. hemisphaerica über mindestens zwei Kopien des Brachyury-Gens13,33.

Eine gründliche phylogenetische Analyse ist erforderlich, um die Entwicklung der Brachyury-Gene bei Nesseltieren zu verstehen, insbesondere um festzustellen, ob es beim gemeinsamen Hydrozoen-Vorfahren zu Genduplikationen kam oder ob es mehrere unabhängige linienspezifische Ereignisse gab. Um dieses Problem zu lösen, wollten wir den phylogenetischen Baum der Brachyury-Gene innerhalb des Stammes Cnidaria rekonstruieren. Unsere Daten deuten auf eine erste Genduplikation beim gemeinsamen Vorfahren der Meduzozoa hin. Bemerkenswerterweise hat Brachyury eine weitere Verdoppelung in der Hydrozoen-Linie erfahren, wobei wir bei den meisten Arten drei Paralogs von Brachyury fanden. Als nächstes zeigte die Analyse der Genexpressionsmuster von Brachyury-Paralogs im Hydrozoan Dynamena pumila während der normalen Entwicklung und in der Kolonie, dass sich die Expressionsdynamik von DpBra3 stark von der Expression von DpBra1 und DpBra2 unterscheidet. Da bekannt ist, dass Brachyury ein direktes Zielgen des cWnt-Signalwegs ist33,34, haben wir getestet, ob alle drei Brachyury-Paralogs noch unter der Regulierung des cWnt-Signals stehen. Daten aus pharmakologischen Modulationen zeigen, dass DpBra3 im Vergleich zu DpBra1 und DpBra2 unterschiedlich reguliert wird. Zusammengenommen legen unsere Ergebnisse nahe, dass die Duplikation der Brachyury-Gene zur Neofunktionalisierung von Brachyury3 in der Hydrozoen-Linie führte.

Um die Entwicklung der Brachyury-Genfamilie bei Nesseltieren zu untersuchen, führten wir zunächst eine TBLASTX-Suche des zuvor veröffentlichten Transkriptoms von D. pumila35 mit den veröffentlichten Brachyury-Gensequenzen von C. hemisphaerica als erste Abfrage durch. Wir haben drei Sequenzen von Brachyury-ähnlichen Genen aus dem D. pumila-Transkriptom gewonnen und sie als Abfragen für TBLASTX-Suchen für zehn weitere Medusozoen-Transkriptome verwendet (siehe „Methoden“). Zusammen mit vier bereits bekannten Anthozoensequenzen wurden insgesamt 33 Brachyury-Sequenzen aus 16 Cnidaria-Arten identifiziert.

Ein Maximum-Likelihood-Baum wurde unter Verwendung übersetzter Aminosäuresequenzen mit dem am besten geeigneten JTT++ R5-Modell erstellt (Abb. 1). Für diese Analyse wurden insgesamt 41 Brachyury-Sequenzen verwendet, die alle wichtigen Metazoengruppen außer Porifera repräsentieren. Da die Familie der T-Box-Transkriptionsfaktoren neben Brachyury9 auch Klassen von Tbx-Genen umfasst, wurden Sequenzen metazoischer Tbx-Gene als Außengruppe zur Wurzelbildung des Baums verwendet. Um die Robustheit der Baumtopologie zu testen, haben wir für die Ausrichtung auch die konservative T-Box-Domäne verwendet. Ein zusätzlicher Maximum-Likelihood-Baum mit derselben Gesamttopologie wurde nur unter Verwendung von T-Boxen der analysierten Sequenzen generiert (Ergänzende Informationen, Abb. S1).

Phylogenetischer ML-Baum von Mitgliedern der Brachyury-Familie, verwurzelt mit TBX-Genen. Die Zahlen an den Knoten sind Bootstrap-Werte, die als Prozentsätze angezeigt werden. Die Skala gibt die erwartete Aminosäuresubstitution pro Stelle an. D. pumila-Gene sind fett gedruckt.

Alle analysierten Anthozoenarten besitzen ein einziges Brachyury-Gen (Abb. 1). Unsere transkriptomische Untersuchung ergab jedoch neben Brachyury1 weitere Brachyury-Gene in Medusozoa (Abb. 1). Brachyury-Gene, die nur für Medusozoen gelten, gehören zu den Gruppen Cubozoa, Scyphozoa und Hydrozoa. Sie gruppieren sich zusammen mit den Brachyury/Brachyury1-Genen mit einer hohen Knotenunterstützung (100 % Bootstrap-Wert). Die Brachyury2/3-Gene von Kubozoen und Scyphozoen gruppieren sich, und Brachyury-Gene, die nur aus Hydrozoen stammen, bilden eine Schwestergruppe zu ihnen. Zu den reinen Hydrozoan-Brachyury-Genen gehören wiederum zwei Schwestergruppen, Brachyury2 und Brachyury3, mit einem gut unterstützten Bootstrap-Wert (88 %) (Abb. 1). Interessanterweise ist ein zuvor untersuchtes Brachyury-Transkript (AJ428494.1) von Podocoryne carnea36 unserer Analyse zufolge ortholog zu Brachyury3. Somit verfügen alle analysierten Hydrozoenarten über drei Brachyury-Gene, mit Ausnahme von Craspedacusta sowerbii und Hydra vulgaris, denen Brachyury2 bzw. Brachyury3 fehlen.

Für eine gründlichere Analyse der Brachyury-Gene in Hydra suchten wir nach Brachyury-Transkripten in Genmodellen der Genomanordnungen Hydra 2.0 (Hydra magnipapillata)37 und HydraAEP (Hydra vulgaris)38 mit modifizierter PIA3-Pipeline, wodurch wir die T-Box-Proteinklasse ermitteln konnten Informationen automatisch. Diese Analyse bestätigte, dass Hydra-Genome nur zwei Brachyury-Gene und mehrere T-Box-Gene enthalten (siehe ein Beispiel für die Baumausgabe in den Zusatzinformationen, Abb. S2). Bei der manuellen Suche wurden außerdem nur zwei Brachyury-Gene in Hydra gefunden. All diese Ergebnisse erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass Hydra tatsächlich Brachyury3 verloren hat.

Das Mehrfachsequenz-Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen voller Länge von D. pumila Brachyury-Proteinen ergab, dass ihre T-Boxen etwa 70–77 % Identität aufweisen. Im Gegensatz dazu weisen Sequenzen voller Länge insgesamt eine geringere Aminosäureidentität auf, sodass die verbleibenden Regionen weniger konserviert sind (Abb. 2a, b).

Vergleich der Sequenzkonservierung zwischen abgeleiteten Hydrozoan-Brachyury-Proteinen. (a) Ausrichtung der T-Boxen von D. pumila Brachyury-Proteinen. Aminosäureidentitäten sind blau, Hellblau zeigt an, dass der Rest nicht identisch, aber zumindest dem Säulenkonsens ähnlich ist. (b) Prozentuale Identitätsmatrix von T-Boxen und Brachyury-Proteinen voller Länge in D. pumila. Die Farben hier und unten stellen Bänder der prozentualen Identität dar: Orange, 40–49 %; hellgelb, 50–59 %; leuchtendes Gelb, 60–69 %; Minze, 70–79 %; grün, 80–89 %. (c) Domänenarchitektur der vorhergesagten Hydrozoan-Brachyury-Proteine. Das rote Kästchen entspricht der R1-Repressordomäne. Eine gezackte Kante zeigt an, dass eine Sequenzübereinstimmung nicht mit der gesamten Länge des HMM übereinstimmt, das einen Pfam-Eintrag modelliert. Zahlen geben die Länge des Proteins in Aminosäuren an. (d) Prozentuale Identitätsmatrix von Hydrozoan-Brachyury-Proteinen voller Länge.

Darüber hinaus führten wir ein Mehrfachsequenz-Alignment der abgeleiteten Brachyury-Proteine, eine Vorhersage der funktionellen Domäne durch hmmscan und eine Suche nach der R1-Repressordomäne mit einer Sequenz von R1 aus H. vulgaris Brachyury1 als Abfrage durch33. Hydrozoan-Brachyury1-Proteine ​​weisen bei anderen Arten eine höhere Identität mit homologen Genen auf als Brachyury2 und Brachyury3 (Abb. 2c, d). Die Brachyury1-Identitäten zwischen den Arten waren ebenfalls höher als die Identitäten zwischen Brachyury-Paralogs innerhalb derselben Art (Abb. 2b, d). Nur Brachyury1-Proteine ​​​​haben das Repressions-R1-Fragment in der C-terminalen Region (Abb. 2c, ergänzende Informationen Abb. S3). Scyphozoan- und Cubozoan-Brachyury2/3-Proteine ​​(Ergänzende Informationen, Abb. S3) und Hydrozoan-Brachyury2- und Brachyury3-Proteine ​​(Abb. 2c) haben es verloren. Der Sequenzvergleich zwischen den Arten ergab außerdem, dass von allen analysierten Hydrozoan-Brachyury-Proteinen die Brachyury2-Proteine ​​die kürzesten Sequenzen haben, die N-terminal der T-Box positioniert sind (z. B. 20 Aminosäuren für DpBra2), wohingegen Brachyury3-Proteine ​​die unterschiedlichsten Längen und Unterschiede aufweisen Aminosäureidentität zwischen Hydrozoen (Abb. 2c, d).

Um festzustellen, ob die Brachyury-Paralogs während der Entwicklung von D. pumila unterschiedlich exprimiert werden, analysierten wir die räumlich-zeitliche Verteilung ihrer Transkripte durch In-situ-Hybridisierung auf dem gesamten Reittier.

Bei D. pumila ist die Gastrulation apolar und erfolgt hauptsächlich über die Epithelisierung der äußeren Zellen. Diese Art der Gastrulation führt zu Verformungen der Embryonaloberfläche und führt zu mehreren Konkavitäten und Vertiefungen. Somit bilden im Midgastrula-Stadium mehrere epithelisierte toroidale Oberflächen eine embryonale Oberfläche. Diese Verformungen werden gegen Ende der Gastrulation geglättet, wenn nur noch einige Vertiefungen sichtbar sind. Die letzte Vertiefung befindet sich tendenziell im oralen Bereich des Embryos. Diese letzte Vertiefung ist jedoch nicht homolog zu einer Blastoporus39. Am Ende der Gastrulation zeigte die In-situ-Hybridisierung die Expression von DpBra1 in einer einheitlichen breiten Domäne (Abb. 3a), die mit keiner spezifischen Region innerhalb des Embryos im Gastrula-Stadium überlappte. Das Signal wurde sowohl im Ektoderm als auch im Endoderm sichtbar gemacht (Abb. 3b, c). Im Präplanula-Stadium wurde das Expressionssignal in diskreten Bereichen sowohl im Ektoderm als auch im Endoderm nachgewiesen, hauptsächlich am oralen Ende des Embryos (Abb. 3d, e). In der frühen Planula beobachteten wir die DpBra1-Expression im oralen Drittel der Larve (Abb. 3f, g). In der reifen Planula wurde DpBra1 in der oralen Hälfte der Larve exprimiert (Abb. 3h, i). Im Ektoderm beobachteten wir zwei Domänen der DpBra1-Expression. In der Spitze wurde ein in Richtung des oralen Pols gerichtetes Expressionssignal in apikalen Domänen ektodermaler Zellen sichtbar gemacht. Außerdem war die DpBra1-Expression in verstreuten ektodermalen Zellen in der Mitte der Larve sichtbar. Im Endoderm war die Expression nur in wenigen Zellen am oralen Ende vorhanden (Abb. 3j). Abbildung 3k zeigt Expressionsmuster von DpBra1 während der Entwicklung.

Räumliche Expressionsmuster von DpBra1 während der Embryonalentwicklung. (a) Die Expression ist am Ende der Gastrulation in einem breiten Bereich erkennbar. Die weiße Pfeilspitze zeigt auf die Öffnung in der Mitte der Ringfläche. (b,c) Querschnitte des Embryos durch die Ebenen, die durch die weißen gepunkteten Linien in (a) angezeigt werden. Die Expression erfolgt sowohl im Ektoderm (Ect) als auch im Endoderm (End). (d) Exprimierende Zellen befinden sich am oralen Pol der Präplanula. Der Doppelpfeil zeigt die Richtung der oral-aboralen (OA) Körperachse. (e) Das DpBra1-Signal ist im Ektoderm und im Endoderm der mit Murray's Clear (MC)-Lösung gereinigten Präplanula deutlich ausgeprägt. (f,g) Breiter Ausdrucksbereich, der in der frühen Planula auf den oralen Pol ausgerichtet ist. (h) In der reifen Planula wird die Expression im oralen Ende und in einzelnen Zellen in der oralen Körperhälfte beobachtet. (i) Längsschnitt der Planula durch die Ebene, die durch die weiße gepunktete Linie in (h) angezeigt wird. Die Expression ist fast ausschließlich im oralen Ektoderm lokalisiert. (j) Eine Vergrößerung von (i). Der schwarze Pfeil zeigt eine einzelne endodermale Zelle mit DpBra1-Expression an. Die schwarz gestrichelte Linie markiert die Basallamina. (k) Das Schema der Expressionsmuster von DpBra1 während der Entwicklung.

Die DpBra2-Expression wurde sowohl im Ektoderm als auch im Endoderm am Ende der Gastrulation nachgewiesen und bildet ebenfalls eine breite Domäne (Abb. 4a, b). In der Präplanula/frühen Planula wurde die DpBra2-Expression in der oralen Hälfte des Embryos beobachtet, wobei das Signal am oralen Pol stärker ausgeprägt war (Abb. 4c). Im perinukleären Zytoplasma ektodermaler Zellen konzentrierte Transkripte (Abb. 4d). In der reifen Planula beobachteten wir eine DpBra2-Expression im oralen Drittel der Larve mit einer Tendenz zum Pol (Abb. 4e, f). DpBra2-RNA wurde in apikalen Domänen ektodermaler Zellen sichtbar gemacht (Abb. 4g). Die Expression war auch in einzelnen endodermalen Zellen vorhanden (Abb. 4g), wie im Fall von DpBra1 (Abb. 3j). Abbildung 4h zeigt Expressionsmuster von DpBra2 während der Entwicklung.

Räumliche Expressionsmuster von DpBra2 während der Embryonalentwicklung. (a) Breite Expressionsdomäne am Ende der Gastrulation. Die weiße Pfeilspitze zeigt auf die Öffnung in der Mitte der Ringfläche. (b) Gastrula mit Murray's Clear (MC)-Lösung geklärt. Das Expressionssignal wird in den inneren Zellen des Embryos nachgewiesen. (c) Der auf den oralen Pol ausgerichtete Ausdruck deckt die Hälfte der Präplanula/frühen Planula ab. Der Doppelpfeil zeigt die Richtung der oral-aboralen (O-A) Körperachse. (d) Längsschnitt des Embryos durch die Ebene, die durch die weiße gepunktete Linie in (c) angezeigt wird. DpBra2-Transkripte werden im perinukleären Zytoplasma ektodermaler (Ect) Zellen sichtbar gemacht. Endoderm beenden. Die schwarz gestrichelte Linie zeigt die Basallamina. (e) Der orale Ausdruck ist in der reifen Planula leicht auf den Pol ausgerichtet. (f) Längsschnitt der Planula durch die Ebene, die durch die weiße gepunktete Linie in (e) angezeigt wird. Die Expression ist hauptsächlich im oralen Ektoderm lokalisiert. (g) Eine Vergrößerung von (f). DpBra2-Transkripte werden in apikalen Domänen ektodermaler Zellen sichtbar gemacht. Der schwarze Pfeil zeigt eine einzelne endodermale Zelle mit DpBra2-Expression an. Die schwarz gestrichelte Linie markiert die Basallamina. (h) Das Schema der Expressionsmuster von DpBra2 während der Entwicklung.

DpBra3 wurde am Ende der Gastrulation in einer breiten Domäne exprimiert (Abb. 5a) in einem ähnlichen Muster wie DpBra1 und DpBra2. Allerdings unterschied sich das Expressionsmuster von DpBra3 in späteren Entwicklungsstadien drastisch. Im Präplanula-Stadium war das DpBra3-Signal als Gürtel in der Mitte der oral-aboralen Achse sichtbar (Abb. 5b, c). Mit fortschreitender Entwicklung dehnte sich der Ausdrucksbereich aus und deckte den zentralen Teil der frühen Planula ab (Abb. 5d). Längsschnitte (Abb. 5e, f) zeigten, dass Transkripte hauptsächlich in Basaldomänen verstreuter ektodermaler Zellen vorhanden sind. Während sich die Planula verlängerte, setzte sich die Expression im mittleren Teil der Larve in einzelnen ektodermalen Zellen fort (Abb. 5g, h). Ein schwaches Signal trat auch im aboralen Endoderm auf (Abb. 5g, h). Längsschnitte der reifen Planula zeigten deutlich, dass sich flaschenartige (Abb. 5i) und dreieckige (Abb. 5j) Körper von DpBra3-exprimierenden Zellen direkt über der Basallamina oder zwischen Endoderm und Ektoderm befanden. Letztere wandern wahrscheinlich vom Endoderm in Richtung Ektoderm (Abb. 5h). Abbildung 5k zeigt Expressionsmuster von DpBra3 während der Entwicklung.

Räumliche Expressionsmuster von DpBra3 während der Embryonalentwicklung. (a) Breite Expressionsdomäne am Ende der Gastrulation. Die weiße Pfeilspitze zeigt auf die Öffnung in der Mitte der Ringfläche. (b,c) Die Expression bildet einen zentralen Gürtel, der im Ektoderm der Präplanula sichtbar ist. Der Doppelpfeil zeigt die Richtung der oral-aboralen (O-A) Körperachse. (d) Exprimierende Zellen sind als breiter zentraler Gürtel in der frühen Planula sichtbar. (e,f) Längsschnitte der Larve durch die Ebenen, die durch die weißen gepunkteten Linien in (d) angezeigt werden. Die Expression erfolgt ausschließlich ektodermal, die Färbung wird hauptsächlich in Basalzelldomänen sichtbar. (g) In verstreuten Zellen im zentralen Bereich der reifen Larve ist eine intensive Färbung sichtbar. Im aboralen Endoderm wird eine schwache Färbung beobachtet. (h) Längsschnitt der Planula durch die Ebene, die durch die weiße gepunktete Linie in (g) angezeigt wird. Im Ektoderm befinden sich intensiv gefärbte Zellen. (i,j) Explosionen des (h). Direkt über der Basallamina liegen säulen- und dreieckige Körper exprimierender Zellen. Ect Endoderm, Ende Endoderm. Die schwarz gestrichelte Linie markiert die Basallamina. (k) Das Schema der Expressionsmuster von DpBra3 während der Entwicklung.

Darüber hinaus untersuchten wir die Expressionsmuster der drei Brachyury-Gene in den Koloniesprossen von D. pumila. D. pumila bildet monopodial wachsende Kolonien mit biradialer Symmetrie. Die Triebe der Kolonie bestehen aus sich wiederholenden Modulen. Jedes Modul besteht aus einem Sprossfragment in der Mitte und zwei Hydranten an den Seiten (Abb. 6a). Aufgrund des sich wiederholenden morphogenetischen Zyklus in dem spezifischen Organ – der Sprosswachstumsspitze – bilden sich auf der Oberseite neue Module (Abb. 6b). Stufe 1 stellt den Zustand dar, in dem der morphogenetische Zyklus noch nicht begonnen hat (Abb. 6b1). Im Stadium 2 beginnt das Wachstum mit einer nach oben gebogenen apikalen Oberfläche der Spitze (Abb. 6b2). Im Stadium 3 verlängert sich die Spitze und nimmt eine halbkugelförmige Form an (Abb. 6b3). Im Stadium 4 teilt sich die Wachstumsspitze in den zentralen und zwei seitliche Teile (Abb. 6b4). Seitliche Primordien differenzieren sich weiter zu Hydranten, während der mittlere Teil zur neuen Triebwachstumsspitze wird (Abb. 6b1*).

Räumliche Expressionsmuster von Brachyury-Genen in der Kolonie von D. pumila. (a) Der Spross der D. pumila-Kolonie. Gelbe Klammer zeigt die Triebwachstumsspitze (sgt), weiße Klammer – ein Modul (mdl) des Triebs. h Hydranthe. (b) Das Schema des morphogenetischen Zyklus in der Sprosswachstumsspitze von D. pumila. Die Nummern 1–4 geben aufeinanderfolgende Stadien der Morphogenese an. Nach der Bildung des neuen Internodiums beginnt der Zyklus von neuem (Sternchen). (c) Räumliche Expressionsmuster von Brachyury-Genen in den Triebwachstumsspitzen im Stadium 2 und 4 des morphogenetischen Zyklus. Im Stadium 2 ist die DpBra1-Expression im zentralen apikalen Teil der Triebwachstumsspitze erkennbar. Die DpBra2-Expression ist auf den gegenüberliegenden Seiten der Spitze der Triebwachstumsspitze sichtbar. Im Stadium 4 ist die DpBra1-Expression im Apex einheitlich. Die DpBra2-Expression bleibt auf den gegenüberliegenden Seiten der Spitze bestehen. Pfeile zeigen auf die Ausdrucksbereiche. Eine Expression von DpBra3 wurde nicht nachgewiesen. (d) Räumliche Expressionsmuster von Brachyury-Genen in Hydranten (Gesamtmontage und Längsschnitt durch die Mitte des Hydranten). Die Expression von Brachyury-Genen ist im Hypostom der Hydranthe erkennbar. Schwarze Pfeilspitzen weisen auf eine Ausprägung im Endoderm hin. Die rote Pfeilspitze weist auf eine Ausprägung im Ektoderm hin.

Wir analysierten die Expressionsmuster von drei Brachyury-Genen in Triebspitzen in den Stadien 2 und 4 des morphogenetischen Zyklus und in vollständig ausgebildeten differenzierten Hydranten. Die Expression von DpBra1 und DpBra2 wurde im apikalen Ektoderm der Wachstumsspitze nachgewiesen (Abb. 6c). DpBra1 wird im zentralen Teil des Apex im Stadium 2 und gleichmäßig im Stadium 4 exprimiert. Die DpBra2-Expression wurde in zwei Domänen auf gegenüberliegenden Seiten des Apex im Stadium 2 und 4 beobachtet. Daher überlappen die Expressionsdomänen DpBra1 und DpBra2 im Stadium nicht 2, werden aber im Stadium 4 coexprimiert. Die DpBra3-Expression wurde in der Sprosswachstumsspitze nicht nachgewiesen.

Die Expression von drei Brachyury-Genen wurde im Hypostom der Hydranthe beobachtet (Abb. 6d). Ein Längsschnitt durch die Mitte der Hydranthe ergab, dass DpBra1 sowohl im Ekto- als auch im Endoderm exprimiert wurde. Das DpBra2-Signal war im Endoderm des Hypostoms deutlich sichtbar, während das Vorhandensein eines Signals im Ektoderm unklar ist. Leider war das DpBra3-Signal für die Feinuntersuchung zu schwach, scheint aber im Ektoderm exprimiert zu sein (von der Oberfläche aus gesehen).

Es wurde zuvor bei Hydra und C. hemisphaerica gezeigt, dass zwei Hydrozoan-Brachyury-Gene, Brachyury1 und Brachyury2, durch cWnt-Signalisierung reguliert werden13,33,40,41. Es ist jedoch nicht bekannt, ob Brachyury3 nach dem Duplikationsereignis immer noch ein cWnt-abhängiges Gen ist. Wir haben die Abhängigkeit von drei Brachyury-Genen vom cWnt-Signalweg in D. pumila untersucht. Wir behandelten Embryonen im Gastrula-Stadium mit unterschiedlichen Konzentrationen pharmakologischer Wirkstoffe, um den cWnt-Signalweg zu modulieren, kultivierten sie bis zum Planula-Stadium und untersuchten dann die Expressionsmuster von drei Brachyury-Genen in Planula-Larven von D. pumila (Abb. 7). Azakenpaullon (Azk) aktiviert die cWnt-Signalisierung und iCRT14 hemmt sie42,43,44. In einer früheren Studie wurde gezeigt, dass eine Hyperaktivierung des cWnt-Signals zu einer Vergrößerung der oralen Domäne der Larven führt, während ihre Hemmung zu einer Verringerung der oralen Domäne bei D. pumila führt39.

Die Expression von DpBra1 und DpBra2, jedoch nicht von DpBra3, hängt von der Aktivität des cWnt-Signalwegs ab. Pharmakologische Modulationen des cWnt-Signalwegs verändern den Bereich der DpBra1- und DpBra2-Expression in Planula-Larven. Auch die Zahl der endodermalen signalpositiven Zellen nimmt zu (Längsschnitte siehe Details). Eine Hyperaktivierung des cWnt führt zu einer aboralen Verschiebung der DpBra3-Expressionsdomäne. Die cWnt-Hemmung hat keinen nennenswerten Einfluss auf die DpBra3-Expression. Die Pfeilspitze zeigt auf DpBra3-exprimierende Zellen am Mundpol der Larve (siehe Detail). Der Doppelpfeil zeigt die Richtung der oral-aboralen (O-A) Körperachse für alle Larven.

Mit DMSO behandelte (Kontroll-)Larven wiesen eine normale Morphologie und Expressionsmuster von drei Brachyury-Genen auf (Abb. 7). Behandlungen mit steigenden Azk-Konzentrationen führten zu einer allmählichen Erweiterung der DpBra1- und DpBra2-Expressionsdomänen. Nach der Behandlung mit 2,5 μM Azk wurden DpBra1- und DpBra2-Expressionssignale in der gesamten Larve mit Ausnahme der am weitesten aboralen Region beobachtet. Auch die Zahl der endodermalen DpBra1- und Bra2-positiven Zellen nahm zu. Umgekehrt führte die allmähliche Hemmung der cWnt-Signalübertragung mit iCRT14 zu einer flächenmäßigen Verringerung der DpBra1- und DpBra2-Expressionsdomänen (Abb. 7).

Bemerkenswerterweise führte eine Überaktivierung des cWnt-Signals nicht zur Erweiterung der DpBra3-Expressionsdomäne. Der Gürtel der DpBra3-exprimierenden Zellen verschob sich immer weiter in aborale Positionen und gab die zentrale Domäne frei. Als Ergebnis der Behandlung mit 2,5 μM Azk wurden mehrere DpBra3-exprimierende Zellen am aboralen Pol der Larve nachgewiesen (Abb. 7: Pfeilspitze). Die Hemmung des cWnt-Signals veränderte die DpBra3-Expressionsdomäne nicht wesentlich (Abb. 7).

Um funktionelle Unterschiede von drei D. pumila Brachyury-Genen aufzudecken, verwendeten wir das Xenopus laevis-Tierkappen-Assay-System. Mit diesem Assay untersuchten wir DpBra1, DpBra2 und DpBra3 auf ihre Fähigkeit, das Zellschicksal naiver Xenopus-Tierkappenzellen zu beeinflussen. Es ist bekannt, dass sich unbehandelte Tierkappen in epidermales Gewebe differenzieren45, aber die Injektion mit Xenopus Bra- oder Hydra Bra1-mRNA fördert die Mesodermspezifikation und Hydra Bra2-mRNA zeigt neuronale induzierende Aktivität33,46. Wir injizierten abgedeckte mRNAs, die für DpBra1, DpBra2 oder DpBra3 kodieren, in die Tierregion von Embryonen im Zwei- bis Vierzellstadium (~ 1 ng pro Embryo), sezierten die Tierkappen im Blastula-Stadium (Stadium 8) und kultivierten sie bis zur Kontrolle von Embryonen erreichten das späte Neurula-Stadium (Stadium 18) und untersuchten die Markergenexpression in diesen Kappen mithilfe konventioneller oder quantitativer RT-PCR (qRT-PCR). Als Kontrollgruppe wurden nicht injizierte Tierkappen verwendet.

DpBra1 induzierte signifikant (P < 0,0001) die Expression des mesodermalen Markergens actc1.L (Muskelaktin)47 (Abb. 8a) sowie die Expression eines anderen mesodermalen Markergens, myod.S47. Da die myod.S-Expression für eine zuverlässige Quantifizierung in der Kontrollgruppe mittels qRT-PCR zu niedrig war, verwendeten wir eine Gelelektrophorese, um die Induktion zu zeigen (Abb. 8c). DpBra1 hatte keinen Einfluss auf die Expression des neuronalen Markergens tubb2b.S47 (Abb. 8b), während DpBra2 und DpBra3 keinen Einfluss auf die Expression neuronaler und mesodermaler Markergene hatten (Abb. 8).

Molekularer Phänotyp von Xenopus-Tierkappen, denen D. pumila Brachyury-Gene injiziert wurden. (a,b) RT-qPCR-Analyse zur Induktion von actc1.L, myod2.S und tubb2b.S durch D. pumila Brachyury-mRNAs. Die Daten werden als normalisierter Fold-Change-Ausdruck (Mittelwert ± Standardabweichung) in Versuchsgruppen dargestellt. n n-Wert. Die Anzahl der Versuchsgruppen beträgt 3, 3 und 2 in (a); 3, 2 und 2 in (b). ***p < 0,001. (c) Gelelektrophorese für myod.S nach Injektion von D. pumila Brachyury-mRNAs. NC-Negativkontrolle. L DNA-Leiter. Die Pfeilspitze zeigt auf die 500-bp-Bande der DNA-Leiter. Siehe nicht verarbeitetes Gelbild in der Zusatzinformation Abb. S4.

Genduplikationen erleichtern die Entwicklung regulatorischer Gene und treiben die Erweiterung von Familien von Signalmolekülen und Transkriptionsfaktoren voran48,49. Das Duplikationsereignis erzeugt zwei Kopien (Paralogs) eines Gens, die beide ortholog zum „Eltern“-Gen sind. Nachfolgende Evolution kann zu Divergenzen führen: Eine Kopie behält eine hohe Ähnlichkeit zu ihren Orthologen, während die zweite strukturelle Veränderungen erfährt und als Tochter- oder Kindkopie bezeichnet werden kann50. In der vorliegenden Studie wurden drei paraloge Gene des Brachyury-Transkriptionsfaktors in der Hydrozoen-Linie gefunden. Die phylogenetische Rekonstruktion lässt darauf schließen, dass das erste Duplikationsereignis vor der Abzweigung der Hydrozoengruppe stattfand (im gemeinsamen Vorfahren der Meduzosen oder früher). Die „Tochter“-Kopie der ersten Duplikation (Brachyury2/3) erlebte dann ein zusätzliches Duplikationsereignis im gemeinsamen Vorfahren der Hydrozoen (Abb. 1).

Nach der Genduplikation gibt es drei Hauptszenarien. Das erste Ergebnis führt zum Funktionsverlust der duplizierten Kopie, die zu einem Pseudogen wird oder verloren geht. Zwei weitere Ergebnisse sind Subfunktionalisierung und Neofunktionalisierung51,52. Im Falle einer Subfunktionalisierung teilen sich zwei duplizierte Kopien die ursprüngliche Funktion des Vorfahrengens, und beide sind erforderlich, um die gesamte Vorfahrenfunktion zu bewahren51,53. Überlappende Expressionsdomänen zweier Duplikate spiegeln häufig eine erfolgte Subfunktionalisierung wider51. Im Falle einer Neofunktionalisierung behält eine Kopie ihre angestammten Funktionen und die andere Kopie kann eine neue Funktion übernehmen, da sie vom Selektionsdruck befreit ist53 und häufig eine andere Expressionsdomäne als das angestammte Gen erhält54,55. Der Erwerb neuer Funktionen durch regulatorische Gene spielt eine Schlüsselrolle bei der Diversifizierung von Entwicklungswegen und Körperplänen bei Metazoen56,57. Wichtig ist, dass dasselbe Duplikat auch sowohl Merkmale der Sub- als auch der Neofunktionalisierung in Bezug auf unterschiedliche Funktionen aufweisen kann58.

Die Entwicklung von Brachyury zeigt Anzeichen sowohl einer Sub- als auch einer Neofunktionalisierung. Bei Knochenfischen zeigt die Expression zweier Brachyury-Gene das gemeinsame Akkordatmuster28,59. Nur der gleichzeitige Verlust beider Brachyury-Gene rekapituliert den homozygoten Brachyury-Mutanten-Phänotyp der Maus4,28, was auf eine Subfunktionalisierung nach Verdoppelung von Brachyury in Knochentieren hinweist. Im Gegenteil scheint die Neofunktionalisierung der Brachyury-Duplikation in X. laevis zu folgen, da sich XBra3 (tbxt2.L/tbxt2.S) in Funktion und räumlich-zeitlichem Ausdrucksmuster von XBra und XBra2 (tbxt,L/tbxt,S) unterscheidet60. Innerhalb von Hydrozoen wurden die Ergebnisse der Brachyury-Duplikation zuvor in Hydra33 untersucht. Obwohl beide Brachyury-Paralogs im Hypostom von Hydra zum Ausdruck kommen, entwickelten sie unterschiedliche Kodierungssequenzen und divergierten in ihren Funktionen. Die Autoren gehen davon aus, dass Brachyury-Paralogs eine Mischung aus Sub- und Neofunktionalisierung in Hydra33 aufweisen. Es ist jedoch nicht bekannt, ob ähnliche Ergebnisse die Rolle der Brachyury-Gene bei anderen Nesseltieren beeinflusst haben.

Brachyury-Gene sind auch bei anderen untersuchten Nesseltieren an der axialen Musterung beteiligt 14. Bei Nesseltierarten mit polarer Gastrulation, wo sie mit der axialen Musterung verbunden ist und im oralen Bereich des Embryos auftritt61, begleitet die Brachyury-Expression die morphogenetischen Bewegungen der Gastrulation12,19,20, 36. Bei der Gastrulation von C. hemisphaerica zeigen Brachyury-Paralogs (ChBra1 und ChBra2) überlappende Muster19 und sind wichtig für das Fortschreiten der Gastrulation13. In D. pumila werden während der Gastrulation alle drei Brachyury-Paralogs in einem breiten Bereich exprimiert (Abb. 3a, 4a, 5a). Im Gegensatz zu den Nesseltierarten mit polarer Gastrulation12 ist es unwahrscheinlich, dass Brachyury-Gene bei D. pumila für die Abgrenzung der Ekto-Endoderm-Grenze sorgen, da die Keimschichtspezifikation bei dieser Art nicht mit der axialen Polarität und der oralen Region insbesondere während der Gastrulation verbunden ist39.

Die überwiegend orale Expression der Brachyury-Gene setzt sich während des gesamten Lebenszyklus des Nesseltiers fort. Brachyury wird in Pharynxen von Anthozoenlarven 12,20 und im oralen Ektoderm von Hydrozoenlarven in C. hemisphaerica und D. pumila exprimiert, wo die Expression von Brachyury1 und Brachyury2 nachgewiesen wird19 (Abb. 3h – j, 4e – g). Überraschenderweise sind Brachyury3-Orthologe nicht mit Mundgewebe in Hydrozoenlarven assoziiert. Zuvor untersuchtes Brachyury-Ortholog von P. carnea, das gemäß unserer Analyse mit der Brachyury3-Gruppe in den aboralen Ektoderm36-Clustern exprimiert wird (Abb. 1). In D. pumila zeigt Brachyury3 eine Expression in diskreten dreieckigen und flaschenähnlichen ektodermalen Zellen (Abb. 5g – j), die morphologisch den Sinneszellen des Nesselnervensystems ähneln62, obwohl Brachyury bekanntermaßen als neuronaler Repressor im Anthozoon Nematostella wirkt14. Darüber hinaus scheint DpBra3 nicht cWnt-abhängig zu sein, was im Gegensatz zur berichteten Wnt-Abhängigkeit der Brachyury-Expression bei Nesseltieren und Bilateriern 14,63, einschließlich DpBra1 und DpBra2, steht (Abb. 6). Brachury3-Orthologe weisen eine starke Diversität in Länge und Aminosäureidentität innerhalb der Hydrozoan-Brachyury-Genfamilie auf (Abb. 2c, d). Unterschiede in den Proteinsequenzen, der Regulation und den Expressionsdomänen legen nahe, dass das neu abgeleitete Brachyury3 bei Hydrozoenarten unterschiedliche Funktionen ausübte.

In der Hydranthe von D. pumila unterscheidet sich das Expressionsmuster von DpBra3 nicht wesentlich von den Mustern von DpBra1 und DpBra2 und steht im Einklang mit früheren Studien33,36,64,65. Alle drei Brachyury-Paralogs wurden im Hypostom von Hydranthen mit überlappenden Mustern entdeckt (Abb. 6d). Wahrscheinlich ist die ursprüngliche Funktion von Brachyury in einem Hydrozoen-Hydranthen mit der Spezifizierung einer oralen Domäne (eines Hypostoms) als Ganzes verbunden. Wie bei Hydra33 deuten überlappende Expressionsdomänen von Brachyury-Paralogen in Hypostomen von D. pumila-Hydranthen auf eine stattgefundene Subfunktionalisierung hin51.

In der Sprosswachstumsspitze von D. pumila-Kolonien66 werden DpBra1 und DpBra2 stark in ihrem apikalen Ektoderm exprimiert (Abb. 6c), das als Derivat der oralen Larvendomäne angesehen werden könnte. Die Assoziation der DpBra2-Expression mit der Bildung von Hydranthenprimordien weist auf die neuartige Funktion von DpBra2 in den Hydranthenprimordien von D. pumila hin.

Die Spezifität der Brachyury-Funktion wird hauptsächlich durch die N- und C-terminalen Domänen definiert, nicht jedoch durch die zentrale T-Box9,67. In Übereinstimmung mit früheren Studien33 und unseren Daten (Abb. 8) steht eine hohe funktionelle Erhaltung der Hydrozoan-Brachyury1-Orthologen im Einklang mit einer hohen Erhaltung der Proteinsequenz (Abb. 2c). Unsere Daten weisen jedoch auf die funktionelle Divergenz von Brachyury2 und Brachyury3 hin. In Xenopus-Tierkappentests verursachten DpBra2 und DpBra3 keine erhöhte Expression der mesodermalen Marker actc1.L oder myod.S (Abb. 8a, c). In Brachyury2 und Brachyury3 weisen N- und C-terminale Domänen eine geringere Aminosäureidentität mit dem angestammten Gen auf und haben die angestammte C-terminale Repressionsdomäne R1 verloren (Abb. 2a – c). Diese Unterschiede in den terminalen Domänen könnten für die Neo- und Subfunktionalisierung von Brachyury2 und Brachyury3 in Hydrozoen verantwortlich sein, obwohl vermutet wurde, dass sie hauptsächlich auf Mutationen in regulatorischen Sequenzen und nicht auf Mutationen in der kodierenden Sequenz zurückzuführen sind68.

Zusammengenommen deuten unsere Daten auf zwei Duplikationsereignisse von Brachyury bei Nesseltieren hin. Brachyury1 ist das konservativste Duplikat, sowohl auf Funktions- als auch auf Sequenzebene. Bei den untersuchten Hydrozoen und insbesondere bei D. pumila soll es seine angestammte Funktion als entscheidender Bestandteil der Achsenbildung und -musterung beibehalten. Hydrozoan Brachyury 2 und Brachyury 3 weisen Merkmale einer Sub- und Neofunktionalisierung auf. Brachyury3 weist jedoch zwischen den Hydrozoen starke Unterschiede in der Reihenfolge und den Funktionen auf. Unsere Daten zu Brachyury stützen das Modell einer undeutlichen Grenze zwischen Sub- und Neofunktionalisierung und komplexen Ergebnissen für duplizierte Gene 58 und stellen ein vielversprechendes Modell für Studien zu Post-Duplikationsszenarien dar.

Die Probenahme von D. pumila-Kolonien und experimentelle Verfahren an D. pumila-Embryonen wurden während der Zeit von D. pumila in der Biologischen Station Pertsov White Sea (Lomonossow-Universität Moskau) (Kandalaksha-Bucht; 66°340 N, 33°080 E) durchgeführt sexuelle Fortpflanzung (Juni–Juli). Geschlechtsreife Kolonien wurden in natürlichem Meerwasser bei + 10–12 °C gehalten. Unter einem Stereomikroskop vom Typ Leica M165C wurden Ganzkörperbeobachtungen durchgeführt.

Um die cWnt-Signalübertragung zu aktivieren/hemmen, wurden gastruierende Embryonen mit 0,5/1/2,5 μM 1-Azakenpaullon (Sigma, Kanada/China) bzw. 1/2,5/10 μM iCRT-14 (Sigma, USA/China) behandelt. Stammlösungen wurden mit 10 mM DMSO hergestellt, aliquotiert und bei –20 °C gelagert. Arbeitslösungen wurden vor der Verwendung durch Verdünnung der Stammlösungen in gefiltertem Meerwasser (FSW) auf die Endkonzentration hergestellt. Kontrollembryos wurden in FSW 0,1 % DMSO ausgesetzt. Arbeitslösungen wurden täglich aktualisiert. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln.

Um phylogenetische Beziehungen innerhalb der Brachyury-Genfamilie zu analysieren, haben wir 28 Metazoenarten untersucht. Gensequenzen wurden aus mehreren Quellen erhalten (Ergänzungsinformationstabelle S1). Bilaterian-, Ctenophor-, Placozoan- und Anthozoan-Sequenzen wurden aus der Nukleotidsammlung der NCBI-Datenbank erhalten. Einige zusammengesetzte Nesseltier-Transkriptome wurden aus öffentlichen Datenbanken am NCBI (Aurelia aurita, Morbakka virulenta, Nemopilema nomurai, Podocoryna carnea, Lucernaria quadricornis, Tripedalia cystophora69, Dynamena pumila35, Polypodium hydriforme70) oder anderen Websites (Clytia hemisphaerica71, Hydractinia symbiolongicarpus72) heruntergeladen ), Hydra38) . Transkriptome von Craspedacusta sowerbii und Margelopsis haeckelii wurden von uns neu zusammengestellt. Daten für Margelopsis haeckelii wurden de novo gesammelt und sequenziert und sind in unserem Labor verfügbar. Die Lesequalitätskontrolle wurde mit der Software fastp (v.0.20.0)73 durchgeführt. De-novo-Transkriptome wurden mit der Software rnaSPAdes (v.3.13.1)74 zusammengestellt. Die Qualität der Montage wurde mithilfe von BUSCO v.3.0.2 mit der Metazoan-Datenbank75 bewertet.

Die Brachyury-Gene ABJ16449.1 und JAC85032.1 von C. hemisphaerica wurden als Abfragen für die lokale tblastx-Suche nach Brachyury-Genen im D. pumila-Transkriptom verwendet. Unter Verwendung von drei erhaltenen Sequenzen von Brachyury-ähnlichen Genen von D. pumila als Abfrage suchten wir in zehn anderen Medusozoen-Transkriptomen nach Brachyury-ähnlichen Genen. Wir haben insgesamt 12 Medusozoen-Transkriptome untersucht (Ergänzungsinformationstabelle S1). Wir verwendeten auch Sequenzen von Bilaterian-, Ctenophor-, Placozoan- und Anthozoan-Brachyury-Genen.

Nukleotidsequenzen ohne entsprechende Proteinsequenz in der NCBI-Datenbank wurden mit Transdecoder v5.5.0 übersetzt. Die Suche nach T-Boxen in analysierten Sequenzen wurde mit dem NCBI Conserved Domain Search Tool durchgeführt. Aminosäuresequenz-Alignments und phylogenetische Analysen wurden mit dem MUSCLE-Algorithmus in der MUSCLE-Software (v3.8.31)76 durchgeführt. Als Fremdgruppe wurden Sequenzen von Tbx-Genen ausgewählt. Sequenzausrichtungen wurden durch Entfernen schlecht ausgerichteter Regionen mit dem TrimAL-Tool, v.1.2rev5977, gekürzt. Ein heuristischer Ansatz „automated1“ wurde verwendet, um die beste automatische Methode zum Trimmen unserer Ausrichtungen auszuwählen. Das Trimmen erfolgte ohne manuelle Anpassung. Die phylogenetische Analyse wurde mit Maximum Likelihood unter Verwendung der Software IQTree v.2.0-rc278 durchgeführt. Als optimal erwies sich das Modell JTT + R5. Um die Zweigunterstützung zu bewerten, wurden Bootstrap-Werte berechnet, indem 1000 Replikate mit ultraschnellem Bootstrap (UFBoot)79 ausgeführt wurden. Bäume wurden in der Software FigTree v1.4.4 visualisiert. Die erhaltenen phylogenetischen Bäume wurden mit Adobe Illustrator CC verarbeitet. An der Baumtopologie und den Zweiglängen wurden keine Korrekturen vorgenommen.

Wir suchten nach Brachyury-Transkripten in Genmodellen von Hydra 2.0- und HydraAEP-Genomassemblierungen unter Verwendung der phylogenetisch informierten Annotationspipeline PIA380. Die PIA3-Pipeline wurde von PIA281 geändert und ist auf GitHub82 verfügbar. Durch Modifikationen konnten wir automatisch Informationen zur T-Box-Proteinklasse abrufen.

Um funktionelle Domänen des Hydrozoens Brachyury zu analysieren, wurden ausgewählte Proteinsequenzen mit hmmscan von HmmerWeb v.2.41.183 anhand der Pfam Hidden Markov Model (HMM)-Datenbank gescannt. Die Identifizierung der konservierten R1-Domäne im Hydrozoan Brachyury wurde mithilfe des ClustalW Sequence Alignment Service84 mit der R1-Domäne in HyBra133 als Abfrage durchgeführt. Die Domänenarchitektur von Proteinen wurde mit Pfam85 visualisiert. Das Alignment mehrerer Sequenzen und die Berechnung der Identitätsmatrix von Hydrozoan-Brachyury-Proteinen und T-Boxen von D. pumila Brachyury wurden mit ClustalW mit Standardeinstellungen durchgeführt und mit BOXSHADE 3.21 schattiert.

Die cDNA-Expressionsbibliothek wurde nach dem SMART-Ansatz aus gesamter embryonaler RNA mit einem Mint-cDNA-Synthesekit (Evrogen, Russland) hergestellt. cDNA-Genfragmente wurden durch PCR mit genspezifischen Primern aus der Bibliothek isoliert (siehe Tabelle 1). Die Primer wurden auf der Grundlage von Sequenzen entworfen, die aus dem sequenzierten Transkriptom (Illumina) von D. pumila35 erhalten wurden. Amplifizierte Fragmente wurden in den pAL-TA-Vektor (Evrogen, Russland) kloniert. Digoxygenin-markierte Antisense-RNA-Sonden wurden aus Genfragmenten erzeugt, die aus Plasmiden mit D. pumila-Genen amplifiziert wurden.

Das In-situ-Hybridisierungsprotokoll wurde wie zuvor in 66 für Triebe und Hydranten von D. pumila und in 39 für D. pumila-Embryonen beschrieben durchgeführt. Für die Hydranten wurde eine auf Harnstoff basierende In-situ-Hybridisierungsmethode verwendet86.

Die Triebe wurden mit 0,2 % Glutaraldehyd/4 % Formaldehyd in FSW für 1 Minute und dann für eine weitere Stunde mit 4 % Formaldehyd in FSW fixiert. Die Proben wurden dreimal mit PTw (1 × PBS mit 0,1 % Tween 20) gewaschen und bis zur Hybridisierung höchstens über Nacht bei –20 °C in 100 % Methanol gelagert. Embryonen wurden mit 4 % Paraformaldehyd in FSW über Nacht bei +4 °C fixiert, mit PBS gespült und bis zur Hybridisierung bei –20 °C in 100 % Methanol gelagert.

Die Proben wurden mit PTw rehydratisiert und 1–3 Minuten lang mit Proteinase K (80 μg/ml, 22 °C) behandelt. Um die endogene alkalische Phosphatase zu inaktivieren und ein falsch positives Ergebnis zu vermeiden, wurden die Proben 30 Minuten lang auf + 80 °C erhitzt. Die Hybridisierung wurde bei 62 °C (Sprossen) oder 58 °C (Embryonen) mit Digoxigenin-markierten Antisense-RNA-Sonden (1 ng/μL) durchgeführt. Zum Nachweis der Sonde wurden Anti-DIG-Antikörper mit alkalischer Phosphatase (Roche; 1/2000 verdünnt) und NBT/BCIP-Substrat (Roche) verwendet. Gefärbte Proben wurden mit PTw und Methanol gewaschen, um die Hintergrundfärbung zu reduzieren, und in Glycerin (87 %) eingelegt.

Mehrere Proben wurden mit Murray's Clear-Lösung (2:1-Mischung aus Benzylbenzoat und Benzylalkohol) behandelt, um eine optische Gewebereinigung zu erreichen. Mehrere Proben wurden in Technovit-Harz eingebettet. Schnitte (5–7 μm dick) wurden mit dem Ultra-Cut 701701-Ultramikrotom von Reichert-Jung (Leica) (Reichert-Jung, Österreich) geschnitten. Die Abbildung der Proben wurde mit dem Mikroskop Leica M165C (Leica, Deutschland) durchgeführt, das mit der Digitalkamera Leica DFC420C (5,0 MP) ausgestattet war.

Wildtyp-Xenopus laevis wurden vom European Xenopus Resource Centre (EXRC) an der University of Portsmouth, School of Biological Sciences, Großbritannien, oder Xenopus 1, USA, bezogen. Die Wartung und Pflege der Frösche wurde gemäß den Standardverfahren in der AquaCore-Einrichtung der Universität Freiburg, Medizinisches Zentrum (RI_00544) und auf der Grundlage von Empfehlungen der internationalen Xenopus-Community-Ressourcenzentren NXR und EXRC sowie von Xenbase (http://www. xenbase.org/, RRID:SCR_003280). Diese Arbeiten wurden unter Einhaltung der deutschen Tierschutzgesetze durchgeführt und unter der Registrier-Nr. G-18/76 des Landes Baden-Württemberg.

X. laevis-Eier wurden gesammelt und in vitro befruchtet, dann kultiviert und nach Standardverfahren mikroinjiziert87. Den Embryonen wurden zwei Mal pro Embryo mRNAs im Zwei-Zellen- oder Vier-Zellen-Stadium injiziert, wobei ein PicoSpritzer-Aufbau in 1/3× modifizierter Frog-Ringer-Lösung (MR) mit 2,5 % Ficoll PM 400 (GE Healthcare, Nr. 17-0300-50) verwendet wurde ) und wurden nach der Injektion in 1/3× MR mit Gentamycin überführt. Die Tropfengröße wurde auf etwa 7–8 nL pro Injektion kalibriert. Injizierte oder nicht injizierte (Kontroll-)Embryonen wurden bis St. kultiviert. 8. Tierkappen wurden in 1× modifizierter Barth-Lösung (MBS) präpariert und in 0,5× MBS + Gentamycin überführt. Pro Bedingung und Experiment wurden 10–15 Organoide in TRIzol gesammelt.

D. pumila Brachyury-Sequenzen in voller Länge wurden aus der cDNA-Bibliothek amplifiziert und in das Plasmid pCS2 + 8 kloniert. pCS2 + 8 war ein Geschenk von Amro Hamdoun (Addgene-Plasmid #34931; http://n2t.net/addgene:34931; RRID:Addgene_34931)88. mRNAs wurden mit dem Ambion mMessage Machine Kit unter Verwendung von Sp6 (#AM1340), ergänzt mit RNAse-Inhibitor (Promega #N251B), nach Plasmidlinearisierung mit Not1 hergestellt und mit 50 ng/μl injiziert.

Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines Standardprotokolls von Trizol (Invitrogen Nr. 15596026) extrahiert und für die cDNA-Synthese mit einem der iScript-cDNA-Synthesekits (Bio-Rad Nr. 1708891) verwendet. qPCR-Reaktionen wurden mit Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad #172-5275) auf einem CFX Connect Real-Time System (Bio-Rad) in 96-Well-PCR-Platten (Marke #781366) durchgeführt. Konventionelle PCR und Gelelektrophorese wurden analog auf einem S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad) durchgeführt. Genspezifische Primer finden Sie in Tabelle 1.

Die Expressionswerte wurden gegen zwei Housekeeping-Kontrollgene normalisiert – EF1 und ODC (2∆∆Ct-Methode). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (sd) der relativen Faltungsänderung (rFC) dargestellt, die ein Verhältnis des normalisierten mRNA-Spiegels der analysierten Genexpression in der Versuchsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe darstellt.

Statistische Analyse der normalisierten Genexpressionsdaten nach Durchführung der qRT-PCR in der GraphPad Prism 5-Software. Die Normalität der Datenverteilung wurde durch die Kolmogorov-Smirnov-Tests überprüft. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Dunnet-Post-hoc-Test bewertet. Die Bedeutung wird in den Diagrammen durch Sternchen angezeigt. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde für alle Analysen als signifikant angesehen. Alle Experimente wurden mit angepassten Kontrollbedingungen konzipiert, um einen statistischen Vergleich zu ermöglichen. Der n-Wert beträgt 7 für eine Kontrollgruppe. Der n-Wert für jede Versuchsgruppe wird in Diagrammen angegeben.

Bilder wurden mit Adobe Photoshop CS6-Programmen bearbeitet. Um eine optimale Belichtung und einen optimalen Kontrast zu erzielen, wurden Änderungen an „Helligkeit“, „Kontrast“, „Belichtung“ und „Stufen“ für den RGB-Kanal vorgenommen. Alle Werkzeuge wurden auf das gesamte Bild und nicht lokal angewendet.

Die in dieser Studie erhaltenen Sequenzen wurden in der GenBank hinterlegt (OP828770–OP828776, OP902368, OP902367).

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Referenzen herunterladen

Wir danken NA Pertsov White Sea Biological Station der Moskauer Staatlichen Universität für die Hilfe und Unterstützung bei der Probenbeschaffung und der Bereitstellung des Zugangs zu allen erforderlichen Einrichtungen und Geräten des „Center of Microscopy WSBS MSU“. Wir danken Dr. Amro Hamdoun für das pCS2+8-Plasmid (Addgene-Plasmid Nr. 34931).

Die Arbeit im Walentek-Labor wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Emmy Noether-Programms (Stipendium WA3365/2-2) und im Rahmen der Deutschen Exzellenzstrategie (CIBSS-EXC-2189-Projekt-ID 390939984) gefördert. SK wird durch das Projekt Nr. 0088-2021-0009 des Koltzov-Instituts für Entwicklungsbiologie der RAS unterstützt. Die Untersuchung der molekularen Strukturierung der D. pumila-Kolonie wurde von RFBR mit der Projektnummer 20-04-00978a (an SK) finanziert.

Labor für Morphogenese-Evolution, Koltzov-Institut für Entwicklungsbiologie RAS, Vavilova 26, Moskau, 119334, Russland

Alexandra A. Vetrova und Stanislav V. Kremnyov

Abteilung für Embryologie, Fakultät für Biologie, Staatliche Lomonossow-Universität Moskau, Leninskiye Gory 1/12, Moskau, 119234, Russland

Daria M. Kupaeva und Stanislav V. Kremnyov

Institute of Science and Technology Austria (ISTA), Am Campus 1, 3400, Klosterneuburg, Österreich

Alena Kizenko

Abteilung für molekulare Evolution und Entwicklung, Zentrum für Organismale Systembiologie, Universität Wien, Althanstraße 14, 1090, Wien, Österreich

Tatiana S. Lebedeva

Nierenabteilung, Innere Medizin IV, Medizinisches Zentrum, Medizinische Fakultät, Universität Freiburg, 79106, Freiburg, Deutschland

Peter Valentin

CIBSS-Zentrum für Integrative Biologische Signalstudien, Universität Freiburg, 79104, Freiburg, Deutschland

Peter Valentin

Institut für Anatomie und Embryologie, Universitätsmedizin Göttingen, Kreuzbergring 36, 37085, Göttingen, Deutschland

Nikoloz Tsikolia

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AAV führte die Experimente durch, führte eine Sequenzanalyse durch, führte eine statistische Analyse durch, interpretierte die Ergebnisse, verfasste den Manuskriptentwurf und bereitete die Zahlen vor. DMK stellte Transkriptome zusammen und führte eine phylogenetische Analyse von Brachyury-Proteinsequenzen in voller Länge durch. AK suchte mithilfe einer phylogenetisch informierten Annotationspipeline nach Brachyury-Genen in Hydra-Genomen. TSL beteiligte sich an der Durchführung der Experimente. PW führte einen Tier-Cap-Assay und eine quantitative RT-PCR durch. NT beteiligte sich an der Datenvisualisierung. SVK konzipierte, gestaltete und überwachte die Studie, führte die Experimente durch, führte eine phylogenetische Analyse der T-Box-Domänen durch und interpretierte die Ergebnisse. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen, überarbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Stanislav V. Kremnyov.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Vetrova, AA, Kupaeva, DM, Kizenko, A. et al. Die Evolutionsgeschichte der Brachyury-Gene in Hydrozoa beinhaltet Duplikationen, Divergenz und Neofunktionalisierung. Sci Rep 13, 9382 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35979-8

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Eingegangen: 20. Januar 2023

Angenommen: 26. Mai 2023

Veröffentlicht: 09. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35979-8

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